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下一代测序

基因测序图

离子激流PGM上每个核苷酸流中每个DNA序列的三种可能情况.

下一代测序(NGS)是指一系列不同的技术，这些技术都是相对较短的核酸序列(25到600个核苷酸)并行测序, 通过序列合成(SBS)技术的高通量方法. 在排序反应之后, 生物信息学工具将这些序列重新组装成整个基因组, 将RNA序列映射到参考基因表达数据, 或者许多其他更专业和特定于newbb电子程序的方法，包括, 但不限于, 染色质immuno-precipitation-seq, RNA结构测序, dna甲基化, SNPseq, 16 s宏基因组, 微生物组特征.

总会在工作流

所有NGS实验都遵循相同的广义工作流，该工作流由三个基本步骤组成(图1). 1):

  1. 图书馆准备 -核酸(DNA或RNA)是碎片化的(声学、化学、酶等).)，并连接到专门的链接器，其中包括启动网站和索引/条形码.
  2. 浓缩 -使用针对连接物设计的引物进行文库富集，以便只在可测序的DNA上进行扩增. 文库的质量控制和绝对定量保证了文库在测序前的存在.
  3. 测序与分析 -使用基于SBS的多种方法对DNA进行测序. 然后对数据进行质量分析(通常在测序仪上)，并使用各种生物信息学软件进行可视化.

以上描述了任何NGS实验的基本步骤, 有许多不同的NGS平台. The goal of each NGS platforms is the same large quantities of high quality data; however, 获取这些数据的方式各不相同. newbb电子平台基因组学设施拥有两个不同的NGS平台, 离子激流个人基因组机(PGM)和Illumina公司MiSeq.

离子激流PGM

SBS不能在DNA分子的混合群体上进行, 因此, 起始材料必须被分离成单独的DNA序列，这样一个信号检测器就可以检测到一个同质的DNA群体. 为了实现这个目标, Ion Torrent使用乳液PCR将单个DNA序列连接到isp(离子球粒子)上并进行扩增，从而使整个表面被单个均匀的DNA种群覆盖. 建立一个包含dNTPs、聚合酶和必要缓冲液的反应混合物. 然后将反应混合物装入乳液PCR机(Ion One Touch 2)，与反应油混合形成H气泡2O内油，乳化. 所产生的气泡的大小仅足以容纳单个ISP和DNA分子. 乳化后的聚合酶链反应进行在标准PCR, 有变性循环, 退火, 和延伸重复，直到ISP的表面被原始DNA序列的副本覆盖. 然后将这些模板isp加载到半导体芯片中(如下所述).

离子激流利用半导体芯片技术，通过监测H的pH值变化来对DNA进行测序+ 离子释放随着每个核苷酸的加入而发生. 这种监测发生在测序芯片的水平上(图1). 3). 测序芯片由晶圆片组成, 哪个是半导体部分和芯片外壳, 这只是晶圆片的物理包装(图. 3、顶部图片). 晶圆片包含数百万个传感器孔，可以捕获和隔离单个isp(图2). 3、右下). 每口单井(图1. 3，左下)包含感知H所需的结构+ 离子释放，以及在每个周期中填充、排出和清洗每个核苷酸的孔.

测序机的每个周期都有一个dNTP流过芯片(因此也流过isp)，这样它就可以被整合到不断增长的测序链中. 在分子中加入dNTP会导致H的释放+，从而降低pH值并改变该传感器的电导率(图2). 4). 这种电导率的变化被记录为核苷酸的增加. 然后，所有未结合的核苷酸被洗掉，下一个dNTP被洗过芯片. 重复数百次，为每口井生成序列.

在每个测序流程中，可能会出现3种不同的场景(如图2所示). 5). dNTP是:

  1. 不与下一个碱基互补，也不包含dNTP.
  2. 与下一个碱基互补，并合并了单个dNTP.
  3. 与多个碱基和多个dNTP互补.

半导体芯片将记录上述每个场景如下:

  1. pH值没有变化，因此没有记录核苷酸同一性.
  2. pH值的变化与单核苷酸的加入直接相关.
  3. pH值变化较大, 变化的幅度直接取决于添加到生长链上的核苷酸的数量.

pH值的变化被记录下来，然后由计算机解释，最后作为核酸序列报告给研究人员.

Illumina公司MiSeq

Illumina化学依靠SBS, 和离子激流一样, 因此, 接头连接DNA的混合种群必须分离，以便能够检测到单个序列. 而离子激流技术则依赖于离子球粒子和乳液聚合酶链反应来固定DNA, Illumina使用流动细胞技术和桥式扩增来固定DNA.

DNA文库是变性的, 使用氢氧化钠, 变成单链DNA, 然后在流动池上冲洗. 在流动细胞中有数百万个与接头序列互补的寡核苷酸点，文库DNA将与它们结合. 结合后的流动细胞, DNA, 由于自然的灵活性, 会掉下来并与另一个与DNA分子另一端的接头序列互补的寡核苷酸接触吗. 第二个寡核苷酸用作引物位点, 并复制出原始DNA序列. 这个反应重复很多次，直到流动池的一个小区域充满了由文库中的单个DNA片段产生的DNA序列. 这个区域被称为星团, 它们的形成过程是聚类生成, 用来形成簇的技术被称为桥式放大. 在流动池上生成集群后，可以开始测序步骤. 第一个, 测序引物流经细胞，从已添加的接头内的已知序列中引物DNA.

在这一点上，离子激流和Illumina技术之间的另一个区别变得明显. 而不是基于添加0来检测电导率的变化, 1, 或者多于1个核苷酸, Illumina使用荧光标记的dNTPs，其中所有四种dNTPs都用不同的荧光团标记. 另外, 每个dNTP都设计了一个可逆的停止，以防止每个流添加多个dNTP.

在每次流动过程中，单个核苷酸被添加到流动细胞上的每个簇中. 在核苷酸流动之后，机器通过两个不同的过滤器捕捉到流动细胞的图像，这使得它能够识别在每个簇中合并的核苷酸. 一旦图像被捕获, 可逆停止从每个序列中移除，所有四个dntp的另一个流发生，产生另一个图像. 这些步骤导联的重复循环产生了一组图像，这些图像代表了进入流式细胞的整个核酸序列. 然后，Illumina系统分析生成的所有图像，以确定每个集群的顺序，并将这些结果报告给研究人员.

无论NGS采用何种平台，下一步都是对产生的数据进行分析. 存在大量的生物信息学资源来帮助解释生成的数据.